**法定義（2005年版一部）
附錄ⅩⅥ **法
**法系指用適當的物理或化學手段將物品中活的微生物殺滅或除去的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫療器械等物品的**。
無菌物品是指品中不含任何活的微生物。對于任何一批**產品來說，**無菌既無法保證，也無法用試驗來證實。實際生產過程中，**是指將物品中污染的微生物殘存概率下降至一定水平，以無菌保證水平SAL(sterilityassurance level)表示。*終**的產品微生物存活概率不得高10{-6}。已**產品達到的無菌保證水平可通過驗證確定。
**產品達到的無菌保證不能依賴于*終產品的無菌檢驗，而是取決于生產過程中采用合格的**工藝、嚴格的GMP管理和良好的無菌保證體系。**工藝的確定應綜合考慮被**物品的性質、**方法的有效性和經濟性、**后物品的完整性等因素。
**程序的驗證是無菌保證的必要條件。**程序經驗證后，方可交付正式使用。驗證內容包括：
（1）撰寫驗證方案及制定評估標準。
（2）確認**設備技術資料齊全、安裝正確，并能處于正常運行（安裝確認）。
（3）確認關鍵控制設備和儀表能在規定的參數范圍內正常運行（運行確認）。
（4）采用被**物品或模擬物品進行重復試驗，確認**效果符合規定（性能確認）。
（5）匯總并完善各種文件和記錄，撰寫驗證報告。
日常生產中，應對**程序的運行情況進行監控，確認關鍵參數（如溫度、壓力、時間、濕度、**氣體濃度及吸收的輻照劑量等）均在驗證確定的范圍內。**程序應定期進行再驗證。當**設備或程序發生變更（包括**物品裝載方式和數量的改變）時，應進行再驗證。
產品的無菌保證與**前產品被污染的程度及污染的特性相關。因此，應嚴格監控被**品**前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生產的各個環節采取各種措施降低污染，確保微生物污染控制在規定的限度內。
**冷卻階段，應采取措施防止已**物品被再次污染。任何情況下，都應要求容器及其密封系統確保產品的有效期內符合無菌要求。
**方法
常用的**方法有濕熱**法、干熱**法、輻射**法、氣體**法和過濾**法。可根據被**物品的特性采用一種或多種方法組合**。只要產品允許，應盡可能選用*終**法**。若產品不適**用*終**法，可選用過濾**法或無菌生產工藝達到無菌保證要求，只要可能，應對非*終**的產品作補充性**處理（如流通蒸汽**）。
一、濕熱**法
本法系指將物品置于**柜內利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質、核酸發生變性而殺滅微生物的方法。該法**能力強，為熱力**中*有效、應用*廣泛的**方法。藥品、容器、培養基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發生變化或損壞的物品，均可采用本法**。流通蒸汽不能完全殺滅**孢子，一般可作為不耐熱無菌產品的輔助**手段。
濕熱**條件通常采用121℃*15min、121℃*30min、或116℃*40min的程序，也可采用其他溫度和時間參數，但必須保證物品**后的SAL《10-6。對熱穩定的物品，可采用過度殺滅法，其SAL應《10-12。熱穩定性較差產品的標準**時間F0［指**溫度為121℃，生物指示菌的耐熱參數D值為1分，**溫度系數Z值為10.0℃時的標準**時間（121℃下計算的微生物等效滅活率）］一般不低于8min。如產品的熱穩定性很差時，可允許濕熱**的F0低于8，此情況下，應在生產全過程中，對產品中污染的微生物嚴加監控，并采取各種措施降低微生物污染水平，確保被**產品達到無菌保證要求。
采用濕熱**時，被**物品有適當的裝載方式，不能排列過密，以保證**的有效性和均一性。
濕熱**法應確認**柜在不同裝載時可能存在的冷點。當用生物指示劑進一步確認**效果時，應將其置于冷點處。本法生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（sporesof Bacillus stearothermophilus）。
二、干熱**法
本法系指將物品置于干熱**柜、隧道**器等設備中，利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質的方法。適用于耐高溫但不宜用濕熱**法**的物品**，如玻璃器具、金屬材質容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法**。
干熱**條件一般為160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min以上，也可采用其他溫度和時間參數。應保證物品**后的SAL《10-6。干熱過度殺滅后物品的SAL應《10-12，此時物品一般無需進行**前污染微生物的測定。250℃*45min的干熱**也可除去無菌產品包裝容器及有關生產灌裝用具中的熱原物質。
采用干熱**時，被**物品應有適當的裝載方式，不能排列過密，以保證**的有效性和均一性。
干熱**法應確認**柜中的溫度分布符合設定的標準及確定*冷點位置等。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）。**內**滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將小于1000單位的**內**加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內**至少下降3個對數單位。**內**滅活驗證試驗所用的**內**一般為大腸埃希菌內**(Escherichiacoli endoxin )。
三、輻射**法
本法系指**物品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法*常用的60Co-γ射線輻射**。醫療器械、容器、生產輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法**。
采用輻射**法**后的產品其SAL應《10-6。γ射線輻射**所控制的參數主要是輻射劑量（指**物品的吸收劑量）。該劑量的制定應考慮**物品的適應性及可能污染的微生物*大數量及*強抗輻射力，事先應驗證所使用的劑量不影響被**物品的**性、有效性及穩定性。常用的輻射**吸收劑量為25KGy。對*終產品、原料藥、某些醫療器材應盡可能采用低輻射劑量**。**前，應對被**物品微生物污染的數量和抗輻射強度進行測定，以評價**過程賦予該**物品的無菌保證水平。
**時，應采用適當的化學或物理方法對**物品吸收的輻射劑量進行監控，以充分證實**物品吸收的劑量是在規定的限度內。如采用與**物品一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置于規定的部位。在初安裝時劑量計應用標準源進行校正，并定期進行再校正。
60Co-γ射線輻射**法常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores ofBacillus pumilus)。
四、氣體**法
本法系指用化學**劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學**劑有環氧乙烷、氣態過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用于在氣體中穩定的物品**。采用氣體**法時，應注意**氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。
本法中*常用的氣體是環氧乙烷，一般與80%~90%的惰性氣體混合使用，在充有**氣體的高壓腔室內進行。該法可用于醫療器械，塑料制品等不能采用高溫**的物品**。含氯的物品及能吸附環氧乙烷的物品則不宜使用本法**。
采用環氧乙烷**時，**柜內的溫度、濕度、**氣體濃度、**時間是影響**效果的重要因數。可采用下列**條件：
溫度 （54±10）℃
相對濕度（60±10）%
**壓力 8*10〈5〉Pa
**時間 90min
**條件應予驗證 **時，將**腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內達到設定的溫濕度平衡的額定值，再通入經過濾和預熱的環氧乙烷氣體。**過程中，應嚴密監控腔室的溫度、濕度、壓力、環氧乙烷濃度及**時間。必要時使用生物指示劑監控**效果。本法**程序的控制具有一定難度，整個**過程應在技術熟練人員的監督下進行。**后，應采取新鮮空氣置換，使殘留環氧乙烷和其他易揮發性殘留物消散。并對**物品中的環氧乙烷殘留物和反應產物進行監控，以證明其不超過規定的限度，避免產生毒性。
采用環氧乙烷**時，應進行泄露試驗，以確認**腔室的密閉性。**程序確認時，還應考慮物品包裝材料和**腔室中物品的排列方式對**氣體的擴散和滲透的影響。生物指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子（sporesof Bacillus subtilis)。
五、過濾**法
本法系利用**不能通過致密具空濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于熱不穩定的藥品溶液或原料的**。
**過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質依過濾物品的性質及過濾目的而定。藥品生產中采用的**濾膜孔徑一般不超過0.22um。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用，也不能釋放物質，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。濾器和濾膜在使用前應進行潔凈處理，并用高壓蒸汽進行**或作在線**。更換品種和批次應先清洗濾器，再更換濾膜。
過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數下降值LRV（log reduction value)有關。LRV系指規定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數量與過濾后的微生物數量比的常用對數值。即：
LRV =lgN0-lgN
式中 N0為產品**前的微生物數量；
N為產品**后的微生物數量。
LRV用于表示過濾器的過濾**效率，對孔徑為0.22um的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾器面積的LRV應不小于7。因此過濾**時，被過濾產品總的污染量應控制在規定的限度內。為保證過濾**效果，可使用兩個過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。
在過濾**中，一般無法對全過程中過濾器的關鍵參數（濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV）進行監控。因此，在每一次過濾**前后均應作濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或氣體擴散流量試驗，確認濾膜在**過濾過程中的有效性和完整性。**過濾器的使用時間應進行驗證，一般不應超過一個工作日，否則應進行驗證。
過濾**法常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta)。
通過過濾**法達到無菌產品應嚴密監控其生產環境的潔凈度，建議在無菌環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應采用適當的方法進行**，并防止再污染。
六、無菌生產工藝
無菌生產工藝系指必須在無菌控制條件下生產無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍干是*常見的無菌生產工藝。后者在工藝過程中須采用過濾**法。
無菌生產工藝應嚴密監控其生產環境的潔凈度，并應在無菌控制的環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應采用適當的方法進行**，并防止被再次污染。
無菌生產工藝過程的無菌保證應通過培養基無菌灌裝模擬試驗驗證。在生產過程中，應嚴密監控生產環境的無菌空氣質量、操作人員的素質、各物品的無菌性。
無菌生產工藝應定期進行驗證，包括對環境空氣過濾系統有效性驗證及培養基模擬灌裝試驗。
生物指示劑
生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認**設備的性能、**程序的驗證、生產過程**效果的監控等。用于**驗證中的生物指示劑一般是**的孢子。
1.制備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的**方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
（1）菌種的耐受性應大于需**產品中所有可能污染菌的耐受性。
（2）菌種應無致病性。
（3）菌珠應穩定。存活期長，易于保存。
（4）易于培養。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
2.生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應按一定的程序進行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐熱參數，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分表示）等。菌珠應用適宜的培養基進行培養。培養物應制成懸浮液，其中孢子的數量應占優勢，孢子應懸浮于無營養的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數量的一種或多種孢子，可制成多種形式。通常是將一定數量的孢子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也可密封于安培中；有的生物指示劑還配有培養基系統。生物指示劑應選用合適的材料包裝，并設定有效期。載體和 包裝材料在保護生物指示劑 不致污染的同時，還應保證**劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝的設計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體** 物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數據證明二者的等效性。
3.生物指示劑的應用
在**程序的驗證中，盡管可通過**過程 某些參數的監控來評估**效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個**程序有效性*直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產污染菌監控中分離的耐受性*強的微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際**條件下的耐受性，并測定孢子的純度和數量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證**程序有更大的**性。在*終**法中，生物指示劑應放在**柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被**物品。生物指示劑按設定的條件**后取出，分別置培養基中培養，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產品**驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對**手段耐受性差的產品，設計**程序時，根據經驗預計在該生產工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數量。這類產品的無菌保證應通過監控每批**前的微生物污染的數量、耐受性和**程序驗證 所獲得的數據進行評估。
4.常用生物指示劑
（1）濕熱**法 濕熱**法*常用的生物指示劑 為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子 （Spores of Bacillus stearothermophilus,如NCTC 10 007、NCIMB8157、ATCC7953）。D值為 1.5~3.0min,每片（或每瓶）活孢子數5*10〈5〉~5*10〈6〉個，在121℃、19min下應被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridiumsporogenes,如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955），D值為0.4~0.8min。
（2）干熱** 法 干熱**法*常用的生物指示劑 為枯草芽孢桿菌孢子（ Spores ofBacillus subtilis ,如NCIMB8058、ATCC 9372）。D值大于1.5min，每片活孢子數5*10〈5〉~5*10〈6〉個。去熱原驗證時使用大腸埃希菌內**（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000**內**單位。
（3）輻射 **法 輻射**法*常用的生物指示 劑為短小芽孢桿菌孢子（ Sporesof Bacillus pumilus ,如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142）。每片活孢子數10〈7〉~10〈8〉，置于放射劑量25KGy條件下，D值約3KGy。但應注意**產品中所負載的微生物可能比短下芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監控**過程，但不能用于**輻射劑量建立的依據。
（4）氣體**法 環氧乙烷***常用的生物指示菌為枯草芽孢桿菌孢 子（Spores of Bacillussubtilis,如NCTC10073、ATCC9372）。氣態過氧化氫***常用 的生物指示劑 為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Sporesof Bacillus stearothermophilus,如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953）。每片活孢子數1*10〈5〉~5*10〈6〉個。環氧乙烷**中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環氧乙烷濃度為600mg/L，相對濕
度為60%，溫度為54℃下**，60min應被殺滅 。
（5）過濾**法 過濾**法*常用的生物指示 劑為缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta ,如ATCC19 146），用于濾膜孔徑為0.22um的濾器；黏質沙雷菌（Serratin marcescens）（ATCC 14756）用于濾膜孔徑為0.45um的濾器。
