無菌檢查法（2005年版 一部）
附錄ⅩⅢB. 無菌檢查法
無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物污染。
無菌檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內或隔離系統中進行，其全過程中必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。
培 養 基
培養基的制備
培養基可按以下**制備，也可使用按該**生產的符合規定的脫水培養基。配制后應采用驗證合格的**程序**。制備好的培養基應保存在2~25℃、避光的環境。培養基若保存于非密閉容器中，一般在三周內使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內使用。
1.硫乙醇酸鹽流體培養基(用于培養好氧菌、厭氣菌)
酪胨（胰酶水解） 15g 氯化鈉 2.5g
葡萄糖 5g 新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml
L-胱氨酸 0.5g
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml
酵母浸出粉 5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解后，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使**后為7.1±0.2，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2。**。在供試品接種前, 培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5，否則,須經100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。
硫乙醇酸鹽流體培養基置30~35℃培養。
2.改良馬丁培養基（用于培養**）
胨 5.0g 磷酸氫二鉀 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸鎂 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH值約為6.8，煮沸,加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節pH值使**后為6.4±0.2，分裝，**。
改良馬丁培養基置23~28℃培養。
3.選擇性培養基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的**及制法，在培養基**或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑，如聚山梨酯80（用于非水溶性供試品）等。中和劑或表面活性劑的用量應通過驗證。
4.營養肉湯培養基
胨 10g 牛肉浸出粉 3.0g
氯化鈉 5g 水 1000ml
取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，調節pH值使**后為7.2±0.2，分裝，**。
5.營養瓊脂培養基
按上述營養肉湯培養基的**及制法，加入14.0g瓊脂，調節pH值使**后為7.2±0.2，分裝，**。
6.改良馬丁瓊脂培養基
按改良馬丁培養基的**及制法，加入14.0g瓊脂，調節PH值使**后為6.4±0.2，分裝，**。
培養基的適用性檢查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基等應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。
無菌性檢查 每批培養基隨機不少于5支（瓶），培養14天，應無菌生長。
靈敏度檢查。
菌種 培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)［CMCC（B） 26 003］
銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC（B） 10 104］
枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis ) ［CMCC（B） 63 501］
生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色*** (Candidaalbicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Aspergillus niger ) [CMCC(F) 98 003]
菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯獲營養瓊脂培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30~35℃培養18~24小時；接種白色念株菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁培養基中，23~28℃培養24~48小時，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23~28℃培養5~7天，加入3~5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu 的孢子懸液。
培養基接種 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100cfu 的白色念株菌、黑曲霉各2支，另1支不接種 作為空白對照，培養5天。逐日觀察結果。
結果判斷 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管菌生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。
稀釋液、沖洗液及其制備方法
稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的**程序**。
1. 0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000 ml，微溫溶解，濾清，調節PH值至7.1±0.2，分裝，**。
2.PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23 g、氯化鈉4.30g 、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，**。
如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的**前或**后加入表面活性劑或中和劑等。
方法驗證試驗
當建立藥品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。
驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作。對每一對試驗菌應逐一進行驗證。
菌種及菌液制備 同培養基靈敏度檢查。
薄膜過濾法 將規定量的供試品薄膜過濾法過濾，沖洗，在*后 一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基中，或將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規定溫度培養3~5天。各試驗菌同法操作。
直接接種法 取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入小于100cfu的白色念株菌、黑曲霉各2管。其中1管接入規定量的供試品，另1管作為對照品，按規定的溫度培養3~5天。
結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。
方法驗證試驗夜可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品的無菌檢查
檢驗數量 檢驗數量是指一次試驗所用供試品*小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠產品按表1規定；上市產品監督檢查按表2、表3規定。表1、表2、表3中*少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的*小檢驗數量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。
檢驗量 使指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有 規定外，每份培養基接種供試品的量按表2、表3規定。采用直接接種法時，若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。
陽性對照 應根據供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗**的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗***的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗**的供試品，以白色念株菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同培養基靈敏度檢查，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48~72小時應生長良好。
陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物生長及存活無影響。
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的**液對供試品容器表面進行徹底**。如果容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有**過濾器的針頭），向供試品容器內導入無菌空氣，再按無菌操作開啟容器取出內容物。
供試品處理及接種培養基
除另有規定外，按下列方法進行。
1.薄膜過濾法
薄膜過濾法應優先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用 一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法**。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。
水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的*大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，且總沖洗量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品 取規定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml 硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基加入相應的濾筒內。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基的容器中，其中一份做陽性對照用。
可溶于水的固體制劑供試品 取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。
非水溶性制劑供試品 取規定量，直接過濾；或混合溶于含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1%~1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少三次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養基中培養。培養基接種照水溶液供試品項下的方法操作。
可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品 取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速過濾。若無法過濾，應加 入不少于1000ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及培養基接種照非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
無菌氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
裝有**的注射器供試品 取規定量，裝上無菌針頭（非包裝中所佩帶的），若需要可吸入稀釋液或用標簽所示的溶劑溶解，然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
2. 直接接種法
直接接種法即每支（或瓶）供試品按規定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基的容器中。除另有規定外，每個容器中的培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少于10ml。培養基的用量和高度同方法驗證試驗；每種培養基接種的管數同供試品的檢驗數量。
混懸液等非澄清水溶液供試品 取規定量接種至各管培養基中。
固體制劑供試品 取規定量直接接種至各管培養基中，或加入適宜的稀釋液溶解，或按標簽說明復溶后，取規定量接種至各管培養基中。
非水溶性制劑供試品 取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其他適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養基中。或直接接種至聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的各管培養基中。
培養及觀察
上述含培養基的容器按規定的溫度培養14天。培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養基液適量轉種至同種新鮮培養基中或劃線接種于斜面培養基上，**培養2天、**培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁或斜面是否有菌生長；或取培養液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
結 果 判 斷
若供試品均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結果無效：
（1）無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求；
（2）回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。
（3）陰性對照管有菌生長；
（4）供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌 試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。
表1 批出廠產品*少檢驗數量
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供試品 批產量N（個） 每種培養基*少檢驗數量
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注射劑
≤100 10%或4個（取較多者）
100〈N≤500 10個
〉500 2%或20個（取較少者）
大體積注射劑（＞100ml） 2%或10個（取較少者）
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眼用及其他非注射產品
≤200 5%或2個（取較多者）
＞200 10個
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桶裝固體原料
≤4 每個容器
4〈N≤50 20%或4個容器（取較大者）
＞50 2%或10個（取較大者）
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注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養基，那么表中的檢驗數量應加倍。
表2 上市抽驗樣品（液體制劑）的*少檢驗量
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供試品裝量V（ml） 每支樣品接入每管 *少檢驗數量
培養基的*少樣品量 （瓶或支）
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≤1 全量 20 ①
1＜V＜5 半量 10
5≤V＜20 2ml 10
20≤V＜50 5ml 10
50≤V＜100 10ml 10
50≤V＜100（靜脈給藥） 半量 10
100≤V≤500 半量 6
V＞500 500ml 6
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①每種培養基各接種10支供試品。
表3 上市抽驗樣品（固體制劑）的*少 檢驗量
──────────────────────────────────────────────────
供試品裝量M 每支樣品接入每管培 *少檢驗數量
/支、瓶或個 養基的*少樣品量 （瓶或支）
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M＜50mg 全量 20①
50mg≤V＜300mg 半量 10
300mg≤V＜5g 150mg 10
M≥5g 500mg 10②
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①每種培養基各接種10支供試品。
②桶裝固體原料的*少檢驗數量為4個包裝
