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摘要：
尋找超聲破碎后高效率提取致齲菌變異鏈球菌蛋白質(zhì)的*佳放置時間。方法 以裂解液為提取介質(zhì)，采用超聲法破碎**。對比破碎前、后菌形態(tài)并將菌提取液分別放置０ 、１０ 、３０ 、５０ 、７０ min 收集蛋白上清液，通過RC DC 法測定蛋白質(zhì)濃度及蛋白質(zhì)SDS‐PAGE 電泳，比較放置不同時間后的蛋白質(zhì)提取效果。結(jié)果 超聲破碎后，少部分**破碎不完全。RC DC法測定結(jié)果顯示，超聲破碎后放置３０ min 時提取的蛋白質(zhì)濃度高于其他各組（P ＜ ０ ．０５） ，但SDS‐PAGE 電泳顯示蛋白質(zhì)的條帶分布和豐度無明顯差別，推測蛋白質(zhì)的釋放和溶解需要一定時間完成。結(jié)論 超聲法提取變異鏈球菌蛋白質(zhì)后放置３０ min
可顯著提高蛋白質(zhì)提取效率。變異鏈球菌屬于革蘭陽性菌，細胞壁厚且堅韌難以破碎，一般采用的破碎方法有反復(fù)凍融結(jié)合超聲法、氧化鋁粉末混合研磨法、玻璃珠勻漿法以及高壓法等［６‐８］ 。超聲波破碎法是目前提取**蛋白時常用的技術(shù)手段［９‐１０］ 。Thongboonkerd等［１１］研究認為僅通過超聲即可使化膿性鏈球菌達到８０％ 的破碎，但無明確評價**破碎程度的指標。超聲破碎法在大大提高蛋白質(zhì)提取效果的同時，還能增加蛋白質(zhì)的溶解性［１２］ ，且可避免外源性蛋白質(zhì)對樣本的污染［１３］ 。已有實驗表明超聲破碎變鏈菌效果明顯［９ ，１４］ ，而在變鏈菌蛋白質(zhì)組研究中，如何提取樣本的*大量對結(jié)果至關(guān)重要。本實驗將超聲破碎結(jié)束的變鏈菌菌懸液分別放置不同時間，在菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)充分溢出并溶解后，對其中的蛋白進行構(gòu)成及量的測定，探索放置時間對菌懸液中蛋白質(zhì)提取效率的影響。SDS‐PAGE 電泳可根據(jù)相對分子質(zhì)量的不同分離混合蛋白質(zhì)，是分析各蛋白質(zhì)構(gòu)成變化的有效手段［１４］ 。本實驗電泳結(jié)果顯示，超聲后放置不同時間的菌懸液中蛋白質(zhì)的條帶分布及豐度基本相同，提示放置時間對菌懸液中蛋白質(zhì)的構(gòu)成無明顯影響，但對濃度的影響無法通過SDS‐PAEG 電泳**展示。本實驗采用的RC DC 試劑盒法以Lowry 法為基礎(chǔ)，并能夠兼容裂解液中多種試劑成分，同其他蛋白質(zhì)定量測定方法相比，具有精密度高、準確性好等特點［１５‐１６］ 。定量結(jié)果表明，超聲破碎后放置３０ min
的菌懸液中蛋白質(zhì)的濃度*高；放置時間少于３０ min 的菌懸液，隨時間的延長蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，而超過３０ min
所提取的蛋白質(zhì)隨時間的延長濃度下降。經(jīng)掃描電鏡觀察，大部分**破裂后呈絮狀碎片，極小部分**呈現(xiàn)清晰的殘余菌體形態(tài)，個別變鏈菌菌體較為完整。提示胞壁破裂完全的**胞內(nèi)物質(zhì)已充分外流，蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放較徹底。而形態(tài)完整的**胞壁上可能存在有較小的裂口，猜測它們和存在殘余菌體的變鏈菌胞內(nèi)物質(zhì)的釋放需要一定時間完成。在測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時，需保證菌體內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)充分溶解于提取介質(zhì)中。而當?shù)鞍踪|(zhì)的釋放量少，或出現(xiàn)蛋白降解、沉淀等情況時，即導(dǎo)致提取介質(zhì)中蛋白質(zhì)的溶解減少，使測量濃度偏低。本實驗采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破壞蛋白質(zhì)之間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集。還原劑DTT 能夠幫助打開蛋白質(zhì)的二硫鍵，促進半胱氨酸殘基被還原，使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。而蛋白酶抑制劑PMSF 可有效抑制**自身所釋放的蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解。由數(shù)據(jù)可看出，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與裂解后放置時間在０ ～ ３０ min
范圍內(nèi)成正相關(guān)。由此提示，一方面，蛋白質(zhì)的釋放可能隨時間的延長增加；另一方面，提取介質(zhì)中復(fù)雜的試劑成分與蛋白質(zhì)、水解酶的相互作用可能并沒有伴隨裂解過程的結(jié)束而終止，而在裂解后的一段時間內(nèi)繼續(xù)進行。同時，蛋白酶抑制劑PMSF 主要抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，而菌體內(nèi)釋放的其他蛋白酶可能仍存在活性，它們在溶解后與蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度的降低。但放置３０ ～ ７０ min 與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性無明顯規(guī)律，具體作用機制需進一步探索。
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