白藜蘆醇**醚脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評價
摘 要：目的 制備白藜蘆醇**（BTM）脂質(zhì)體，對其質(zhì)量特性進行評價，并考察脂質(zhì)體對BTM的增溶作用。方法 采用薄膜分散法制備BTM脂質(zhì)體，以包封率為評價指標(biāo)，通過正交設(shè)計優(yōu)化**工藝，微柱離心法測定其包封率，觀察其形態(tài)、粒徑及穩(wěn)定性，并考察其對BTM的增溶作用。結(jié)果 優(yōu)化的*佳**工藝：**與磷脂質(zhì)量比為1∶20，膽固醇與磷脂比為1∶4，水化介質(zhì)為5%甘露醇；按該**制備的脂質(zhì)體包封率達（86.4±2.2）%；與游離BTM相比，BTM脂質(zhì)體在水中的溶解度增大了1 012多倍。結(jié)論 采用*佳**制備得到的BTM脂質(zhì)體包封率較高，形態(tài)和粒徑較均勻，脂質(zhì)體可以較好地提高BTM的溶解度。
關(guān)鍵詞：白藜蘆醇**；薄膜分散法；微柱離心法；包封率；正交設(shè)計
白藜蘆醇**（3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene，BTM）是白藜蘆醇的全甲基化衍生物，具有明顯的抗新血管生成、抗有絲分裂作用，可以引起微管分解和微管蛋白解聚，用于抗腫瘤**。此外，BTM具有抗過敏、保護胃粘膜損傷以及抗衰老作用[1-3]。但是BTM難溶于水，光照下易發(fā)生異構(gòu)化并降解，使其應(yīng)用受到限制[4]。脂質(zhì)體可以增加難溶性的**的溶解性，提高光不穩(wěn)定性**的光穩(wěn)定性[5-6]。本實驗將BTM制備成脂質(zhì)體，對其**工藝和質(zhì)量特性進行評價，并考察脂質(zhì)體對BTM的增溶作用。
1 儀器與材料
LC20A—DAD高效液相色譜儀（日本島津），N—1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械公司），Digital sonifier S—450D超聲波細胞粉碎機（美國Branson Sonifier），Nano—ZS90激光散射粒徑儀（英國Malvern公司），Sirion 200場發(fā)射掃描電鏡（荷蘭FEI公司）。BTM對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%，中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供），BTM樣品（中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供），卵磷脂（S100，德國Lipoid公司），膽固醇（天津博迪化工有限公司），葡聚糖凝膠G-50（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司），乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 BTM脂質(zhì)體的制備
采用薄膜分散法[7-8]。精密稱取適量磷脂、膽固醇、BTM于茄形瓶中，加入10 mL氯仿溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，使形成均勻透明的薄膜，加入5%甘露醇溶液15 mL，45 ℃水浴下水化4 h，使薄膜溶脹充分水合完全，得乳白色混懸液；探頭超聲2 min，0.45 μm微孔濾膜擠出，即得BTM脂質(zhì)體。
2.2 BTM定量測定方法的建立
2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（75∶25），柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL/min，檢測波長318 nm，進樣量20 μL。
2.2.2 專屬性試驗 分別取空白脂質(zhì)體、BTM乙腈溶液、BTM脂質(zhì)體各0.2 mL，甲醇破乳并稀釋至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣測定。結(jié)果表明，在此色譜條件下，脂質(zhì)體輔料對BTM定量測定無干擾。
2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取BTM對照品10.0 mg于50 mL量瓶中，加乙腈溶解稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為200.0 μg/mL的BTM儲備液。精密量取上述儲備液適量，乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL的系列溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，以色譜峰峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程A＝134 298.1 C－588.8，r＝0.999 9，表明BTM在0.1～32.0 μg/mL線性關(guān)系良好。
2.2.4 精密度試驗 分別配制質(zhì)量濃度為1.0、8.0、32.0 μg/mL的BTM乙腈溶液各5份，按“2.2.1”色譜條件測定，計算日內(nèi)精密度和日間精密度。日內(nèi)精密度RSD分別為0.27%、0.43%、0.19%，日間精密度RSD分別為1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取BTM脂質(zhì)體混懸液適量，加甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，在0、2、4、6、8、12 h分別測定BTM的峰面積，計算其RSD分別為1.38%、1.06%、0.59%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 重復(fù)性試驗 取BTM脂質(zhì)體混懸液適量，加甲醇稀釋至濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，連續(xù)測定5次，其質(zhì)量濃度基本無變化，RSD分別為0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率試驗 精密吸取0.2 mL空白脂質(zhì)體于5 mL量瓶中，分別加入25、200、400 μL質(zhì)量濃度為200.0 μg/mL的BTM乙腈儲備液，加入甲醇破乳并稀釋至刻度，重復(fù)3次，得質(zhì)量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的樣品溶液，分別進樣測定，計算回收率。3種質(zhì)量濃度的回收率分別為101.3%、99.3%、99.6%，RSD分別為0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱離心法[9-11]測定BTM脂質(zhì)體的包封率
2.3.1 微型凝膠柱的制備 稱取葡聚糖凝膠G-50 1.0 g于適量蒸餾水中，浸泡24 h，沸水浴煮沸20 min，使葡聚糖充分溶脹并除去氣泡。靜置冷卻后，裝填于2.5 mL注射器（底部填有適量脫脂棉）中，于離心機中3 000 r/min離心5 min，備用。
2.3.2 洗脫曲線的考察 精密吸取BTM脂質(zhì)體混懸液0.2 mL，加于微柱的頂部，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 mL蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復(fù)以上操作。從第12管開始更換洗脫液，用乙醇-水（3∶2）混合溶劑代替蒸餾水作為洗脫液，操作同上，繼續(xù)收集10管洗脫液。所收集的洗脫液用甲醇破乳并稀釋定容至5 mL。按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定A B C 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
BTM質(zhì)量濃度，以洗脫管號為橫坐標(biāo)，BTM質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖2。可知脂質(zhì)體在前8管基本洗脫完全，BTM游離**則在第13管以后被緩慢洗脫，可見葡聚糖G-50微型凝膠柱可較好地分離脂質(zhì)體與BTM游離**。該方法可用于BTM脂質(zhì)體包封率的測定。
2.3.3 包封率的測定 精密量取BTM脂質(zhì)體混懸液0.2 mL于微柱中，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 mL蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復(fù)以上操作。合并1～8管洗脫液，甲醇稀釋破乳后定容至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定BTM質(zhì)量濃度，記為C脂；另取BTM脂質(zhì)體混懸液0.2 mL，加入甲醇超聲破乳，破乳后甲醇定容至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定BTM質(zhì)量濃度，記為C總，計算包封率。包封率＝C脂/ C總C脂為包封于脂質(zhì)體中的**質(zhì)量濃度，C總為脂質(zhì)體混懸液
中**的總質(zhì)量濃度
2.4 單因素考察
2.4.1 藥脂比對包封率的影響 固定膽固醇與磷脂的比為1∶3、水化介質(zhì)為5%甘露醇、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取BTM與磷脂的質(zhì)量比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制備脂質(zhì)體，測定包封率分別為46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。結(jié)果表明，藥脂比在1∶10以下時包封率可達70%以上。
2.4.2 膜材比對包封率的影響 固定藥脂比為1∶20、水化介質(zhì)為5%甘露醇、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取膽固醇與磷脂的比分別為1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制備脂質(zhì)體，測定包封率分別為68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。結(jié)果表明脂質(zhì)體的包封率隨著膽固醇嵌入量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。膽固醇對于脂質(zhì)體起著膜流動性調(diào)節(jié)劑的作用，能適當(dāng)提高**包封率和穩(wěn)定性。但當(dāng)膽固醇的量過大時，與脂溶性**BTM競爭磷脂雙分子層位置，導(dǎo)致包封率下降。
2.4.3 水化介質(zhì)的種類對包封率的影響 固定膽固醇與磷脂的比為1∶3、藥脂比為1∶20、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取水化介質(zhì)分別為5%甘露醇、0.01 mol/L PBS、蒸餾水制備脂質(zhì)體，測定包封率分別為78.2%、69.4%、72.7%。結(jié)果表明，水化介質(zhì)為5%甘露醇時，脂質(zhì)體的包封率*佳。
2.5 正交設(shè)計優(yōu)化**
在文獻資料[12]及單因素考察試驗基礎(chǔ)上，以包封率為指標(biāo)，選擇**與磷脂質(zhì)量比（A）、膽固醇與磷脂比（B）、水化介質(zhì)的種類（C）為考察因素，每個因素各取3個水平，進行正交設(shè)計，選用L9(34) 正交表安排試驗，制備脂質(zhì)體，測定包封率。。由正交試驗結(jié)果分析可知，影響脂質(zhì)體包封率的因素順序為C＞A＞B，*佳**為A3B2C1，即**與磷脂比為1∶20，膽固醇與磷脂比為1∶4，水化介質(zhì)為5%甘露醇。
2.6 *佳**工藝的驗證
按上述篩選得到的*佳**，制備3批BTM脂質(zhì)體混懸液（約相當(dāng)于BTM 0.33 mg/mL），測定包封率分別為88.7%、84.3%、86.2%。3次驗證試驗的結(jié)果基本一致，說明所確定的優(yōu)化**合理可行，重現(xiàn)性良好。
2.7 BTM脂質(zhì)體形態(tài)
取*佳**制備的BTM脂質(zhì)體適量，用超純水稀釋100倍，以掃描電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)。可見脂質(zhì)體形態(tài)圓整，多為球形及類球形粒子，大小較均一。
2.8 粒徑和Zeta電位的測定取*佳**制備的BTM脂質(zhì)體適量，適當(dāng)稀釋后，用激光散射粒徑儀測定脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位。脂質(zhì)體的平均粒徑為（183.6±2.1）nm，PDI為0.265±0.006，Zeta電位為（−15.3±1.2）mV。
2.9 初步穩(wěn)定性考察
取*佳**制備的BTM脂質(zhì)體3批，置于（4±1）℃冰箱中，于3、5、10 d取樣，分別考察外觀、粒徑、Zeta電位和包封率的變化。結(jié)果BTM脂質(zhì)體在4 ℃條件下放置10 d后，外觀沒有發(fā)生明可以看出，低溫放置10 d，脂質(zhì)體的外觀、粒徑及Zeta電位沒有發(fā)生明顯的變化，包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取過量的BTM原料藥置于具塞試管中，加入超純水，渦旋使分散均勻，于（25±1）℃的恒溫振蕩器中48 h，平衡后取樣，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.2.1”下色譜條件進樣分析，測得BTM在純水中的飽和溶解度為0.32 μg/mL。取適量BTM脂質(zhì)體于西林瓶中，加入10%蔗糖溶液作為凍干保護劑，冷凍干燥，得到凍干脂質(zhì)體。取過量凍干粉于純化水中，振搖復(fù)溶使分散均勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，加入甲醇破乳后，按“2.2.1”下色譜條件進樣分析，測得BTM脂質(zhì)體中**的飽和溶解度為324.2 μg/mL。BTM脂質(zhì)體較其原料藥在水中的飽和溶解度提高了1 012多倍，表明脂質(zhì)體對BTM有較好的增溶作用。
3 討論
BTM難溶于水，為脂溶性**。薄膜分散法簡單易行，適合于脂溶性**脂質(zhì)體的制備。本實驗采用該法制備BTM脂質(zhì)體，通過正交實驗篩選*佳組成。制備過程中，成膜和水化是影響脂質(zhì)體包0.1 1 10 100 1 000 粒徑/ nm −200 −100 0 100 200Zeta電位/ mV 封率與粒徑的關(guān)鍵步驟。成膜太厚、水化不完全，制得的脂質(zhì)體粒徑偏大，放置易聚集，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性；成膜不均勻，導(dǎo)致**未能很好地嵌入脂質(zhì)體雙分子層中，影響脂質(zhì)體的包封率。脂質(zhì)體包封率的測定方法通常有凝膠柱層析法、透析法、超速離心法、微柱離心法等[9-11,13]。凝膠柱層析法消耗時間長，且不易控制洗脫液的體積流量；透析法消耗時間也較長；超速離心法要求較高離心力才能將脂質(zhì)體和游離**分離。微柱離心法是一種快速、簡便地分離脂質(zhì)體中游離**的方法，其優(yōu)點是脂質(zhì)體混懸液幾乎沒有被稀釋，可以避免脂質(zhì)體的滲漏。本實驗采用微柱離心法測定BTM脂質(zhì)體的包封率，脂質(zhì)體與游離**分離效果好，方法簡便，重復(fù)性好。采用*佳**制備的3批脂質(zhì)體，包封率較高，粒徑分布均勻，重現(xiàn)性良好，并且可以顯著提高BTM的溶解度。放置10 d后，外觀和粒徑均未發(fā)生明顯的變化，但包封率略有降低，推測**可能出現(xiàn)滲漏。將脂質(zhì)體凍干，可以顯著降低磷脂的水解和氧化速率，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[14]，實驗擬進一步考察BTM凍干脂質(zhì)體貯存穩(wěn)定性。
參考文獻
[1] Pan M H, Gao J H, Lai C S, et al. Antitumor activity of 3, 5, 4′-trimethoxystilbene in COLO 205 cells and xenografts in SCID mice [J]. Mol Carcinog, 2008, 47(3): 184-196.
[2] Li L, Luo X J, Liu Y Z, et al. The role of the DDAH-ADMA pathway in the protective effect of resveratrol analog BTM-0512 on gastric mucosal injury [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2010, 88(5): 562-567.
[3] Yuan Q, Peng J, Liu S Y, et al. Inhibitory effect of resveratrol derivative BTM-0512 on high glucose-induced cell senescence involves dimethylaminohydrolase/ asymmetric dimethylarginine pathway [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(5/6): 630-635.
[4] 呂春艷, 李 芳, 張?zhí)m桐. 天然產(chǎn)物中二苯乙烯類化合物的研究近況與開發(fā)前景[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009, 30(2): 213-216.
[5] Ioele G, Cione E, Risoli A, et al. Accelerated photostability study of tretinoin and isotretinoin in liposome formulations [J]. Int J Pharm, 2005, 293(1/2): 251-260.
[6] 韓文霞, 李偉澤, 汪興軍, 等. 鹽酸青藤堿納米柔性脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)研究[J]. ***, 2011, 42(4): 671-675.
[7] Lu Y, Li J, Wang G J. In vitroand in vivoevaluation of mPEG-PLA modified liposomesloaded glycyrrhetinic acid [J]. Int J Pharm, 2008, 356(1/2): 274-281.
[8] 琚 輝, 郝存江, 尹 飛, 等. 姜黃素固體脂質(zhì)納米粒的制備及表征[J]. **評價研究, 2010, 33(6): 420-426.
[9] Di Venosa G, Hermida L, Batlle A, et al. Characterisation of liposomes containing aminolevulinic acid and derived esters [J]. J Photochem Photobiol B, 2008, 92(1): 1-9.
[10] Bhatia A, Kumar R, Katare O P. Tamoxifen in topical liposomes: development,characterization and in vitroevaluation [J]. J Pharm Pharm Sci, 2004, 7(2): 252-259.
[11] 于燕燕, 趙繼會, 馮年平, 等. 微柱離心-HPLC 法測定鬼臼**醇質(zhì)體的包封率研究[J]. ***, 2010, 41(10): 1634-1637.
[12] Caddeo C, Teska?K, Sinico C, et al. Effect of resveratrol incorporated in liposomes on proliferation and UV-B protection of cells [J]. Int J Pharm, 2008, 363(1/2): 183-191.
[13] 李唐棣, 郝麗梅, 梅興國, 等. 脂質(zhì)體包封率的研究進展[J]. 國外醫(yī)學(xué): 藥學(xué)分冊, 2006, 33(3): 224-227.
[14] 王 健, 李明軒. 冷凍干燥對提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究概況[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2005, 36(9): 576-580
