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用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項




用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項
 
用大腸桿菌表達外源蛋白，在進行超聲波破碎之前，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些**同樣起作用，比如鏈霉菌。
**沉淀直接加樣品1 buffer，再加5μl的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當(dāng)補點醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率， pbs和tris緩沖液都是這樣，*后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。
1*會產(chǎn)生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。超聲波破碎儀探頭一定要接近底部，約1cm（推薦是距底部0.5mm）。功率根據(jù)儀器不同會有所不同，但你可以觀察液面，有波動但不要太劇烈就好。
2*破3s停10s，破碎20-30個循環(huán)觀察效果。
3*探頭位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。在超聲波破碎時試著加大體積,振幅*好不要超過60%.
4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說，通常方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，*好停頓時間稍長一些，這種情況多見于包涵體形式的蛋白。如果換用Branson超聲波破碎儀來進行工作，由于熱耗較小，停頓周期可適當(dāng)減小。

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