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技術(shù)文章

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(無公害食品豬肉)
中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(無公害食品豬肉)
2001-09-03發(fā)布　 2001-10-01實(shí)施
中華人民共和國農(nóng)業(yè)部　發(fā)布
前　　　　言
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D、附錄E、附錄F為規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國畜產(chǎn)品加工研究會。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周光宏、徐幸蓮、孫京新、湯曉艷、黃明、鄒曉葵。
無公害食品　　　豬肉
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了無公害豬肉的定義、技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、標(biāo)志、包裝、貯存和運(yùn)輸。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于來自非疫區(qū)的無公害生豬，屠宰后經(jīng)獸醫(yī)檢疫合格的豬肉。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB 191　裝儲運(yùn)圖示標(biāo)志
GB 2707 豬肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)
GB 4789．2 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定
GB 4789．3 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定
GB 4789．4 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌測定
GB 4789．17 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 肉與肉制品檢驗(yàn)
GB／T 5009．11 食品中總砷的測定方法
GB／T 5009．12 食品中鉛的測定方法
GB／T 5009．15 食品中鎘的測定方法
GB／T 5009．17 食品中總汞的測定方法
GB／T 5009．19 食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定方法
GB／T 5009．44 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法
GB／T 6388 運(yùn)輸包裝收發(fā)貨標(biāo)志
GB 7718 食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)
GB 12694 肉類加工廠衛(wèi)生規(guī)范
GB／T 14962 食品中鉻的測定方法
GB／T 17236 生豬屠宰操作規(guī)程
GB／T 17996 生豬屠宰產(chǎn)品品質(zhì)檢驗(yàn)規(guī)程
NY 467 畜禽屠宰衛(wèi)生檢疫規(guī)范
NY／T 468 動物組織中鹽酸克倫特羅的測定 氣相色譜——質(zhì)譜法
NY／T 5033 無公害食品 生豬飼養(yǎng)管理準(zhǔn)則
3 技術(shù)要求
3．1 原料
活豬必須來自按NY／T 5033規(guī)定組織生產(chǎn)的養(yǎng)豬廠，并經(jīng)當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)合格。
3．2 屠宰加工
生豬屠宰按GB／T 17236和NY 467規(guī)定進(jìn)行，屠宰加工過程中的衛(wèi)生要求按GBl2694執(zhí)行。
3．3 感官指標(biāo)
感官指標(biāo)應(yīng)符合GB 2707的規(guī)定。
3．4 理化指標(biāo)
理化指標(biāo)應(yīng)符合表1規(guī)定。
表1 無公害豬肉理化指標(biāo)：
項 目 　　 　　　　　　　 指 標(biāo)
解凍失水率，％ 　　　　 　　　　　　≤　8
揮發(fā)性鹽基氮，mg／100g　　　　　　　≤ 15
汞（以Hg計），mg／kg 　　　　　　　 ≤ 按GB 2707
鉛（以Pb計），mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．50
砷（以As計），mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．50
鎘（以Cd計），mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．10
鉻（以Cr計），mg／kg 　　　　　　　 ≤ 1．0
六六六，mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．10
滴滴涕，mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．10
金霉素，mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．10
土霉素，mg／kg 　　　　　　　 ≤ 0．10
氯霉素 　　　　　　　　 　　　　　　不得檢出
磺胺類（以磺胺類總量計），mg／kg ≤ 0．10
伊維菌素（脂肪中），mg／kg 　　 ≤ 0．02
鹽酸克倫特羅 　　　　　　　　　　　 不得檢出
3．5 微生物指標(biāo)
微生物指標(biāo)應(yīng)符合表2規(guī)定。
表2 無公害豬肉微生物指標(biāo)：
項 目 　　　　　　　 指 標(biāo)
菌落總數(shù)，cfu/g　　 　　　≤ 1×10的6次方
大腸菌群，MPN／100g　　　≤ 1×10的4次方
沙門氏菌 　　　　　　　　　不得檢出
4 檢驗(yàn)方法
4．1 感官檢驗(yàn)
按GB／T 5009．44規(guī)定方法檢驗(yàn)。
4．2 理化檢驗(yàn)
4．2．1 解凍失水率
按附錄A規(guī)定方法測定。
4．2．2 揮發(fā)性鹽基氮
按GB／T 5009．44規(guī)定方法測定。
4．2．3 汞
按GB／T 5009．17規(guī)定方法測定。
4．2．4 鉛
按GB／T 5009．12規(guī)定方法測定。
4．2．5 砷
按GB／T 5009．11規(guī)定方法測定。
4．2．6 鎘
按GB／T 5009．15規(guī)定方法測定。
4．2．7 鉻
按GB／T 14962規(guī)定方法測定。
4．2．8 六六六、滴滴涕
按GB／T 5009．19規(guī)定方法測定。
4．2．9 金霉素
按附錄B規(guī)定方法測定。
4．2．10 土霉素
按附錄C規(guī)定方法測定。
4．2．11 氯霉素
按附錄D規(guī)定方法測定。
4．2．12 磺胺類
按附錄E規(guī)定方法測定。
4．2．13 伊維菌素
按附錄F規(guī)定方法測定。
4．2．14 鹽酸克倫特羅
按NY／T 468規(guī)定方法測定。
4．3 微生物檢驗(yàn)
4．3．1 菌落總數(shù)
按GB 4789．2檢驗(yàn)。
4．3．2 大腸菌群
按GB 4789．3檢驗(yàn)。
4．3．3 沙門氏菌
按GB 4789．4檢驗(yàn)。
5 標(biāo)志、包裝、貯存、運(yùn)輸
5．1 標(biāo)志：內(nèi)包裝（銷售包裝）標(biāo)志應(yīng)符合GB 7718的規(guī)定執(zhí)行，外包裝的標(biāo)志應(yīng)按GB 191和GB／T6388的規(guī)定執(zhí)行。
5．2 包裝：包裝材料符合相應(yīng)的國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。
5．3 貯存：產(chǎn)品應(yīng)貯存在通風(fēng)良好的場所，不得與有毒、有害、有異味、易揮發(fā)、易腐蝕的物品同處貯存。
5．4 運(yùn)輸：應(yīng)使用符合食品衛(wèi)生要求的專用冷藏車（船），不得與有對產(chǎn)品發(fā)生**影響的物品混裝。
NY 5029——2001
附 錄 A
（規(guī)范性附錄）
解凍失水率的測定
A．1 儀器和工具
電子秤：感量1g
溫度計：一10攝氏度～50攝氏度，分度值1．5攝氏度。
A．2 抽樣
從每批產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3～7件。樣品在運(yùn)輸過程中應(yīng)使用保溫設(shè)備，以免解凍流失水分。
A．3 測定步驟
將鐵絲網(wǎng)置于搪瓷盤內(nèi)，并使鐵絲網(wǎng)與搪瓷盤底部的距離大于2 cm。從抽取的樣品中切取約1 000g～1 200g，用電子秤稱量后置于鐵絲網(wǎng)上。在樣品上覆蓋塑料膜，使樣品在15攝氏度～25攝氏度自然解凍。待樣品中心溫度達(dá)到2攝氏度～3攝氏度時，用電子秤稱量。再將樣品置于鐵絲網(wǎng)上放置30min稱量，重復(fù)放置30min再稱量，直至連續(xù)兩次稱量差不超過20g。
A．4 測定結(jié)果的表述
樣品解凍失水率按式（A．1）計算：
X（％）= (m—m1 )÷m×100 …………………………………………（A．1）
式中：
X——樣品解凍失水率，單位為百分率（％）；
m——樣品解凍前的質(zhì)量，單位為克（g）；
m1——樣品解凍后的質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結(jié)果保留至整數(shù)。
A．5 允許差
同一樣的兩次測定值之差，不得超過平均值的5％。
NY 5029——2001
附 錄 B
（規(guī)范性附錄）
金霉素殘留的高效液相色譜測定法
B．1 適用范圍
本方法用于測定雞和豬的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織中金霉素的殘留量。
B．2 原理
組織中金霉素經(jīng)MCI—Vaine—Na2EDTA緩沖液（pH4．0）提取，過濾后，通過C18微柱水洗，用草酸甲醇將**洗脫，洗脫液用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。
B．3 可靠的檢測限
本方法在肌肉、肝臟、脂肪和腎臟組織中的檢測限為0．05µg／g。
B．4 儀器
B．4．1 高效液相色譜儀，配紫外檢測器。
B．4．2 勻漿機(jī)。
B．4．3 離心機(jī)。
B．4．4 旋渦混合器。
B．4．5 自動電位滴定計。
B．4．6 磁力加熱攪拌器。
B．4．7 C18微柱。
B．4．8 布氏漏斗。
B．4．9 球形漏斗。
B．4．10 濾膜；0．45／µm。
B．4．11 抽濾瓶。
B．5 藥品和試劑
B．5．1 鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥84％。
B．5，2 乙腈：色譜純。
B．5．3 甲醇：分析純。
B．5．4 乙酸銨：分析純。
B．5．5 檸檬酸：分析純。
B，5．6 依地酸二鈉：分析純。
B，5．7 磷酸氫二鈉：分析純。
B，5．8 草酸：分析純。
B．5．9 三氟乙酸：分析純。
B．5．10 N，N-二甲基甲酰胺：分析純。
B．5．11 草酸銨：分析純。
B．5．12 磷酸氫二銨：分析純。
B．6 溶液
B．6．1金霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取適量鹽酸金霉素，用甲醇溶解，使成濃度為100µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置冰箱保存。臨用前，取此儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為5.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
B．6．2 MCI—Vaine緩沖液：準(zhǔn)確稱取Na2HPO428.41g，用水溶解，定容于1000mL。容量瓶中，簡稱溶液A。準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.00g，用水溶解，定容于1 000mL容量瓶中，簡稱溶液B。取625mL溶液A和1000mL溶液B混勻，調(diào)節(jié)pH至4．0土0．05。
B．6．3 MCI—Vaine—Na2EDTA液：準(zhǔn)確稱取Na2EDTA60.49g溶解于1 625mL的MCI—Vaine液中，使成0.0l mol／L Na2EDTA的MCI—Vaine液。
B．6．4 0.01mol／L草酸甲醇溶液：準(zhǔn)確稱取草酸1.26g，用甲醇溶解并定容于1 000mL容量瓶中。
B．6．5 0.01 mol／L草酸溶液：準(zhǔn)確稱取草酸1.26g，用水溶解并定容于1 000mL容量瓶中。
B．7 分析
B．7．1 提取和純化
B．7．1．1 稱取5．00g組織勻漿放入50mL聚丙烯離心管中，添加TCS**，使成相應(yīng)的濃度。
B．7．1．2 加入20mLMCI—Vaine—Na2EDTA液，蓋上帽，漩渦半分鐘，手搖5 min。
B．7．1．3 　4 500 r／min的速度離心10 min，上清液倒入另一離心管，再加入20 mLMCI-Vaine—Na2EDTA液于沉淀中，漩渦半分鐘，手搖5min。
B．7．1。4 　4 500 r／min的速度離心5 min，上清液倒入上個試管中，再加入10 mLMCI-Vaine—Na2EDTA液于沉淀中，漩渦半分鐘，手搖5min。
B．7．1．5 　4 500 r／min的速度離心5 min，混合全部上清液（共50 mL），4 500 r／min的速度離心10min。
B．7．7．6 用MCI—Vaine—Na2EDTA液濕潤抽濾瓶、布氏漏斗及濾紙，用較小真空（水泵）過濾上清液，2X2mLMCI—Vaine—Na2EDTA液洗離心管并過濾。
B．7．1．7 C18 微柱先依次用20mL甲醇，20 mL水沖洗，之后將過濾的液體倒入50mL注射器中，用2×2mLMCI—Vaine—Na2EDTA液洗抽濾瓶并放入注射器中。
B．7．1．8 過C18微柱，使TCS**吸附在C18微柱上。
B．7．1．9 用20mL水沖洗抽濾瓶倒入注射器中，并過濾，水洗C18微柱。
B．7．1．10 用水沖洗完全后，頂空5min。
B．7．1．11 用6．0mL 0．01mol／L草酸甲醇液把TCS**從C18微柱中洗脫于10mL容量瓶中，用水定容至刻度。
B．7．1．12 上述液用濾膜過濾后，上高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。
B．7．2 測定條件
B．7．2．1 色譜柱：C18柱。
B．7．2．2 流動相：甲醇—乙腈—0.01 mol／L草酸（1.5+1.5+2.0，pH＝2.0）。
B．7．2．3 流速：1.5 mL／min。
B．7．2．4 檢測波長：350nm。
B．7．2．5 進(jìn)樣量：10µL。
B．7．3 樣品測定
分析樣品按上述儀器操作條件供高效液相色譜儀分析。
B．7．4 計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（B．1）計算試樣中金霉素殘留量：
W = H．cs /Hs．C ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．（B．1）
式中：
W——試樣中金霉素殘留量，單位為微克每克（µg／g）；
H——試樣液中金霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
Hs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中金霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中金霉素的濃度，單位為微克每毫升（µg／mL）；
C——*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g／mL）。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。
NY 5029——2001
附 錄 C
（規(guī)范性附錄）
土霉素殘留的高效液相色譜測定法
C．1 適用范圍
本方法用于測定動物可食性組織中土霉素的殘留量。
C．2 原理
組織經(jīng)MCI—Vaine—Na2EDTA緩沖液（pH4．0）提取，過濾后，通過C18微柱水洗后，用草酸甲醇將**洗脫，洗脫液用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。
C．3 可靠的檢測限
本方法在動物可食性組織中的檢測限為0.05µg／g。
C．4 儀器
C．4．1 高效液相色譜儀，配紫外檢測器。
C．4．2 勻漿機(jī)。
C．4．3 離心機(jī)。
C．4．4 漩渦混合器。
C．4．5 自動電位滴定計。
C．4．6 磁力加熱攪拌器。
C．4．7 C18微柱。
C．4．8 布氏漏斗。
C．4．9 球形漏斗。
C．4．10 濾膜：0．45µm。
C．4．11 抽濾瓶。
C．5 藥品和試劑
C．5．1 鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥90％。
C．5．2 乙腈：色譜純。
C．5．3 甲醇：分析純。
C．5．4 乙酸銨：分析純。
C．5．5 檸檬酸：分析純。
C．5．6 依地酸二鈉：分析純。
C．5．7 磷酸氫二鈉：分析純。
C．5．8 草酸：分析純。
C．5．9 三氟乙酸：分析純。
C．5．10 N，N—二甲基甲酰胺：分析純。
C．5．11 草酸銨：分析純。
C．5．12 磷酸氫二銨：分析純。
C．6 溶液
C．6．1土霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取適量鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成濃度為100µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置冰箱中保存。臨用前，取此儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為5.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
C．6．2 MCI—Vaine緩沖液：準(zhǔn)確稱取Na2HPO428.41g，用水溶解，定容于1000mL容量瓶中，簡稱溶液A。準(zhǔn)確稱取檸檬酸21．00g，用水溶解，定容于1 000mL容量瓶中，簡稱溶液B。取625mL溶液A和1000mL溶液B混勻，調(diào)節(jié)pH至4．04-0．05。
C．6．3 MCI—Vaine—Na2EDTA液：準(zhǔn)確稱取Na2EDTA60．49g溶解于1625mL的MCI—Vaine液中，使成含0．01mol／LNa2EDTA的MCI—Vaine液。
C．6．4 0．01 mol／L草酸甲醇：準(zhǔn)確稱取草酸1．26g，甲醇溶解并定容于1 000mL容量瓶中。
C．6．5 0．01 mol／L草酸溶液：準(zhǔn)確稱取草酸1．26g，水溶解并定容于1 000mL容量瓶中。
C．7 分析
C．7．1 提取和純化
C．7．1．1 稱取5．00g組織勻漿（**到0．1g）放入50mL聚丙烯離心管中，添加TCS**，使成相應(yīng)的濃度。
C．7．L 2 加20mLMCI—Vaine—Na2EDTA液，蓋上帽，漩渦半分鐘，手搖5min。
C．7．1．3 以4 500 r／min的速度離心10 min，上清液倒入另一離心管，再加20 mLMCI—Vaine—Na2EDTA液于沉淀中，漩渦半分鐘，手搖5 min。
C．7．1．4 以4 500 r／min的速度離心5 min，上清液倒入上個試管中，再加10 mLMCI—Vaine—Na2EDTA液于沉淀中，漩渦半分鐘，手搖5 min。
C．7．1．5 以4 500r／min的速度離心5min，混合全部上清液（共50mL），以4 500r／min的速度離心10min。
C．7．1．6用MCI—Vaine—Na2EDTA液濕潤抽濾瓶、布氏漏斗及濾紙，用較小真空（水泵）過濾上清液，2×2mLMCI—Vaine—Na2EDTA液洗離心管并過濾。
C 7．1．7 C18微柱先依次用20mE甲醇，20mL水沖洗，之后將過濾的液體倒入50mL注射器中，用2×2mLMCI—Vaine—Na2EDTA液洗抽濾瓶并放人注射器中。
C．7．1．8 過C18微柱，使TCS**吸附在C18微柱上。
C．7．1．9 用20mL水沖洗抽濾瓶倒人注射器中，并過濾，水洗C18微柱。
C．7．1．10 用水沖洗完全后，頂空5min。
C．7．1．11 用6．0mL 0．01mol／L草酸甲醇液把TCS**從C18微柱中洗脫于10mL容量瓶中，用水定容至刻度。
C 7．1．12 上述液用濾膜過濾后，供高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。
C．7．2 測定條件
C 7．2．1 色譜柱：C18柱。
C，7．2．2 流動相：甲醇—乙腈—0．01 mol／L草酸（1．5+1．5+2．5）。
C 7．2．3 流速：1．5 mL／min。
C 7．2．4 檢測波長：350nm。
C．7．2．5 進(jìn)樣量：10µL。
C 7．3 樣品測定
分析樣品按上述儀器操作條件供高效液相色譜儀分析。
C．7．4 計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（C．1）計算試樣中土霉素殘留量：
w=H．Cs / Hs ．c …………………………•（c．1）
式中：
W——試樣中土霉素殘留量，單位為微克每克（µg／g）；
H——試樣液中土霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
Hs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中土霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中土霉素的濃度，單位為微克每毫升（µg／mL）；
C——*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g／mL）。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。
NY 5029——2001
附 錄 D
（規(guī)范性附錄）
氯霉素殘留的氣相色譜測定法
D．1 適用范圍
本方法用于測定肉牛的肌肉組織中氯霉素的殘留量。
D．2 原理
組織經(jīng)β—葡萄糖醛酸酶消化，經(jīng)乙酸乙酯提取，然后將乙酸乙酯濃縮。加4％氯化鈉溶液，剩余的乙酸乙酯用氮?dú)獯蹈伞Ⅺ}溶液過C18萃取小柱，用20％甲醇洗滌，用甲醇洗脫。將洗脫液蒸發(fā)至干并固化，用配有電子捕獲檢測器的氣相色譜儀測定氯霉素。異氯霉素做內(nèi)標(biāo)物定量。
D．3 可靠的檢測限
本方法在牛肌肉組織中的檢測限為1．0ng／g。
D．4 儀器
D．4．1 氣相色譜儀，配電子捕獲檢測器（63Ni）。
D．4．2 電子天平：感量0．000 01g。
D．4．3 勻漿機(jī)。
D．4．4 離心機(jī)。
D．4．5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
D．4．6 振蕩器。
D．4．7 電熱恒溫水浴鍋。
D．4．8 固相萃取柱：C18柱。
D．5 藥品與試劑
D．5．1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。
D．5．2 異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)標(biāo)物。
D．5．3 p—葡萄糖醛酸酶—Ⅸ：生化試劑。
D．5．4 甲醇：色譜純。
D．5．5 乙酸乙酯：分析純。
D．5．6 正己烷：分析純。
D．5．7 三氯甲烷：分析純。
D．5．8 乙腈：色譜純。
D．5．9 環(huán)己烷：分析純。 ，
D．5．?0 氯化鈉：分析純。
D．6 溶液
D．6．1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置4攝氏度冰箱中保存。臨用前，取此儲備液，用甲醇稀釋成濃度為100ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
D．6．2異氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取異氯霉素50mg，用甲醇溶解，使成濃度為500µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置4攝氏度冰箱中保存。臨用前，取此儲備液，用甲醇稀釋成濃度為100ng／mL的內(nèi)標(biāo)液。
D．6．3 0．1 mol／L KH2P04和Na2HPO4的緩沖液（pH6．8土0．1）：用相應(yīng)的干試劑調(diào)節(jié)pH為6．8。
D．6．4 β—葡萄糖醛酸—Ⅸ：用緩沖液稀釋至4 000單位／mL。
D．6．5 Sylon HTP溶液：六甲基二硅烷（HMDS）3份，氯化**基硅烷1份，吡啶9份。
D．7 分析
D．7．1 提取和純化
D．7．1．1 將組織解凍，稱取肌肉組織10g（**到0．1g），置于50mL玻璃離心管中。向每個樣品中加10µL異氯霉素內(nèi)標(biāo)液（100ng／mL）。
D．7．1．2每個分析樣品配制1個空白、3個添加樣品。向空白組織中加內(nèi)標(biāo)。回收率樣品中加工作液，制成0．5mL／L（50µL工作液），1．0mL／L（100µL工作液），2．0mL／L（200µL工作液）的樣品。由添加樣品得到的數(shù)據(jù)用于計算。
D．7．1．3向所有空白、添加對照和樣品管中加15mL磷酸鹽緩沖液（pH6．8土0．1）和200µLβ—葡萄糖醛酸酶（800單位），在室溫條件下混合30s一60s。
D．7．1．4 將所有管置于37攝氏度保溫90min。保溫后，樣品可以放在冰箱中過夜。
D．7．1．5 樣品放回室溫平衡。向各管加乙酸乙酯15mL，旋渦混合30s提取氯霉素。
D．7．1．6 2 000r／min的速度離心2min。
D．7．1．7 用一次性滴管吸取乙酸乙酯液（上層）留用并轉(zhuǎn)移到另一干凈的50mL離心管中。
D．7．1．8 重復(fù)（步驟D．7．1．5～D．7．1．7）提取樣品，并合并提取液。
D．7．1．9 在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60攝氏度的沙浴去除乙酸乙酯使體積約為1 mL。
D．7．1．10 向各管加4％氯化鈉溶液4mL，混合5s～10s。
D．7．1．11 繼續(xù)蒸發(fā)去除乙酸乙酯至乙酸乙酯層干，剩下小量的油性殘留物。
D．7．1．12 向4％氯化鈉溶液層加正己烷4mL，混合10s。2 000r／min的速度離心1 min，棄掉上層。
D．7．1．13 重復(fù)步驟D．7．1．12。
注意：以下步驟D．7．1．14至步驟D．7．1．17必須立即連續(xù)做完。切莫讓吸附劑變干。
D．7．1．14給每個樣品、空白和添加對照準(zhǔn)備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇和10mL水洗滌C18柱。棄掉洗滌液。
D．7．1．15 用一次性巴氏吸管吸取全部水相溶液裝入C18柱過柱，棄掉流出液。
D．7．1．16 用1mL水混合淋洗樣品管2遍，并將淋洗液加入C18柱過柱，棄掉流出液。
D．7．1．17 用1 mL水，然后2mL甲醇—水（2+8）洗滌C18柱。讓*后一次洗滌液完全流出C18柱。棄掉 洗液。
D．7．1．18 用乙腈將C18柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1．5mL，合并洗脫液到一干凈的10mL培養(yǎng)管中。
D．7．1．19 在氮?dú)饬飨拢脺囟燃s60攝氏度的沙浴蒸發(fā)去除乙腈至約為0．5mL。
D．7．1．20 轉(zhuǎn)移至1mL錐形瓶中。用0．5mL乙腈洗滌10mL培養(yǎng)管，旋渦混合5s，并將洗滌液加到1mL錐形瓶中。在60~C用氮?dú)饬鞔蹈伞?br />注意：從這兒開始要防潮。
D．7．1．21 向干的殘留物中加200µL Sylon HTP。
D．7．1．22 蓋塞并旋渦混合5s。在60攝氏度～70攝氏度沙浴中反應(yīng)15min。
D．7．1．23 在60攝氏度用氮?dú)饬鞔蹈扇コ嘤嗟脑噭┱舭l(fā)至10µL。
注意：此步過長的吹干時間可導(dǎo)致丟失分析物。
D．7．1．24 將殘留物重新溶于100／µL 環(huán)己烷—正己烷（6+4）中，旋渦混合5s。
D．7．1．25 注入適量微升體積的衍生物到氣相色譜儀作定量測定。
D．7．2 測定條件
D．7．2．1 色譜柱：DB—1,30m×0.254mm i．d．。
D．7．2．2 載氣：氦氣，線性速度29cm／s。
D．7．2．3 初始柱溫：80攝氏度，維持1min。
D．7．2．4溫度程序：設(shè)定30攝氏度／min升至260~C，維持10min或直到對位異構(gòu)體和氯霉素已經(jīng)流出。然后設(shè)定30攝氏度／min升至300攝氏度，維持5min以確保所有的樣品已經(jīng)流出。
D．7．2．5 進(jìn)樣室溫度：280~C。
D．7．2．6 檢測器溫度：350攝氏度。
D．7．2．7 預(yù)期保留時間：氯霉素10min—11 min，異氯霉素9．5min—10．5min。
D．7．2．8 預(yù)期響應(yīng)值：對0.2ng氯霉素可以達(dá)到50％全刻度。
D．7．2．9 進(jìn)樣量：適量。
D．7．3 樣品測定
分別注入適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及適當(dāng)濃度的樣品溶液于氣相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析。響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。
D．7．4 計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（D．1）計算試樣中氯霉素殘留量：
W＝ w=H．Cs / Hs ．c ………………………………（D．1）
式中：
W——試樣中氯霉素殘留量，單位為微克每克（µg／g）；
H——試樣液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
Hs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的峰高，單位為毫米（mm）；
Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的濃度，單位為微克每毫升（µg／mL）；
c——*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g／mL）。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。
NY 5029——2001
附 錄 E （規(guī)范性附錄）
磺胺類**在動物可食性組織中
殘留的高效液相色譜檢測方法
E．1 適用范圍
本方法用于測定動物可食性組織中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹惡啉（SQ）單個或混合物的殘留量。
E．2 原理
組織經(jīng)乙腈提取后，其上清液再加入正己烷，向離心后的下層溶液加入正丙醇，減壓干燥后的殘留物用乙腈溶解，過Sep—Pak氧化鋁B柱，洗脫液再用正丙醇處理，減壓干燥后的殘留物經(jīng)流動相溶解后，所制樣液用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。
E．3 可靠的檢測限
本方法在動物可食性組織中的檢測限為0．05µg／g。
E．4 儀器
E．4．1 高效液相色譜儀，配紫外檢測器。
E．4．2 勻漿機(jī)。
E．4．3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
E．4．4 磁力攪拌器。
E．4．5 電子天平：感量0．000 01g。
E．4．6 離心機(jī)。
E．4．7 振蕩器。
E．4．8 抽濾器。
E．4．9 離心管。
E．5 藥品和試劑
E．5．1 SMM，SM2，SMZ，SDM，SQ標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。
E．5．2 乙腈：色譜純。
E．5．3 甲醇：分析純，經(jīng)重蒸餾。
E．5．4 乙酸：分析純。
E．5．5 正己烷：分析純，經(jīng)重蒸餾。
E．5．6 正丙醇：分析純，經(jīng)重蒸餾。
E．5．7 無水硫酸鈉：分析純。
E．6 溶液
磺胺類**標(biāo)準(zhǔn)液；準(zhǔn)確稱取適量各個磺胺藥，用甲醇溶解，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用前，取此儲備液，用流動相稀釋成濃度為0．1µg／mL～20µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
E．7 分析
E．7．1 Sep—Pak氧化鋁B柱的制備
稱取高溫下加熱3h的氧化鋁粉，加水?dāng)嚢杈鶆颍袷?h后填充人玻璃柱中，用95％乙腈5mL前處理后備用。
E．7．2 提取和純化
稱取組織樣品5g（**到0．1 g），加入乙腈25mL，無水硫酸鈉少許（血**外），勻漿后，以3000r／min的速度離心5min。分離后的殘渣再用25mL乙腈處理，振蕩10min后，以3000r／min的速度離心5min。合并兩次的上清液，加入正己烷30mL，振蕩10min后，以3000r／min的速度離心5min，取下層液體，加人正丙醇10mL，50攝氏度下減壓干燥，殘留物用95％乙腈3mL溶解，過Sep—Pak氧化鋁B柱。用95％乙腈5mL過柱，不收集，再用70％乙腈10mL洗脫后，洗脫液中加入5mL正丙醇，50C下減壓干燥后，殘留物用2．0mL流動相溶解，所制樣液用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。
E．7．3 檢測條件
E．7．3．1 色譜柱：C18柱，250mm×4．6mm i．d．。
E．7．3．2 流動相：乙腈—甲醇—水—乙酸（2+2+9+0．2）。
E．7．3．3 流動相流速：1．0mL／min。
E．7．3．4 檢測波長：270nm。
E．7．3．5 進(jìn)樣量：20µL。
E．7．4 樣品測定
分別將等體積標(biāo)準(zhǔn)液和試樣溶液注入液相色譜儀，標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣中磺胺類**的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。試樣液測定過程中要參插注入標(biāo)準(zhǔn)工作液，以便準(zhǔn)確定量。
E．7．5 計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（E．1）計算試樣中磺胺類**殘留量：
W=H．Cs / Hs ．c ……………………………………………………（E．1）
式中：
W——試樣中磺胺類**殘留量，單位為微克每克（µg／g）；
H——試樣中磺胺類**峰高，單位為毫米（mm）；
Hs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中磺胺類**峰高，單位為毫米（mm）；
Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中磺胺類**濃度，單位為微克每毫升（µg／mL）；
C——*終試樣液所代表的試樣濃度，單位為克每毫升（g／mL）。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。
NY 5029——2001
附 錄 F
（規(guī)范性附錄）
伊維菌素殘留的高效液相色譜測定法
F．1 適用范圍
本方法用于測定牛、羊、豬肝臟、肌肉和脂肪組織中伊維菌素的殘留量。
F．2 原理
組織中伊維菌素經(jīng)乙腈提取后用C18固相萃取柱凈化，在三氟乙酸酐和N—甲基咪唑存在下，脫水生成熒光化合物，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。
F．3 可靠的檢測限
本方法在動物可食性組織中的檢測限為2ng／g。
F．4 儀器
F．4．1 高效液相色譜儀，配熒光檢測器。
F．4．2 勻漿機(jī)。
F．4．3 離心機(jī)。
F．4．4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或氮?dú)獯嫡粞b置。
F．4．5 旋渦混合器。
F．4．6 SPE柱（C18柱，6mL）。
F．5 藥品和試劑
F．5．1 伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥90％。
F．5．2 乙腈：色譜純。
F．5．3 甲醇；色譜純。
F．5．4 N—甲基咪唑：純度≥99％。
F．5．5 三氟乙酸酐：純度≥99％。
F．6 溶液
F．6．1伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取適量伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，使成濃度為100µg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置一20攝氏度冰箱中保存，可保存一年。臨用前，取此儲備液，用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
F．6．2 水—乙腈溶液（9+1）。
F．6．3 三氟乙酸酐-乙腈溶液（1+2）。
F．6．4 N-甲基咪唑-乙腈溶液（1+1）。
F．7 分析
F．7．1 提取和純化
稱取4．0g組織（**到0．1g），加入40mL乙腈，高速勻漿2min，將樣品轉(zhuǎn)至離心管中，以20000r／min的速度離心10min，沉淀物用乙腈（20mL×2）重復(fù)提取2次，離心后合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60~C）將提取液濃縮蒸去乙腈，向殘留物中添加10mL水，搖勻。
將C18預(yù)柱依次用4mL乙腈和4mL水—乙腈溶液平衡，使樣品液通過C18柱（1mL／min），吹去柱內(nèi)殘留的液體，用5mL乙腈洗脫柱內(nèi)吸附的伊維菌素，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑。向殘留物中依次加入150µL三氟乙酸酐-乙腈溶液和100µLN- 甲基咪唑 - 乙腈溶液，輕輕搖勻后密閉、避光存放，30s后即可供高效液相色譜儀測定。
F．7．2 測定條件
F．7．2．1 色譜柱：C18柱，150mm×4．6mm i．d．，粒度5µm。
F．7．2．2 流動相：甲醇 - 水（95+5）。
F．7．2．3 流動相流速：1．5mL／min。
F．7．2．4 熒光檢測：激發(fā)波長364nm，發(fā)射波長470nm。
F．7．2．5 進(jìn)樣量：10µL。
F．7．3 樣品測定
將分析樣品按上述操作條件供高效液相色譜儀分析。
F．7．4 計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式（F．1）計算試樣中伊維菌素殘留量：
W=H．Cs / Hs ．c ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．（F．1）
式中：
W——試樣中伊維菌素殘留量，單位為微克每克（µg／g）；
H——試樣液中伊維菌素的峰高，單位為毫米（mm）；
Hs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中伊維菌素的峰高，單位為毫米（mm）；
Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中伊維菌素的濃度，單位為微克每毫升（µg／mL）：
C——*終試樣液所代表的試樣的濃度，單位為克每毫升（g／mL）。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。
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